Фармакокинетические исследования доксорубицина. Электрохимические, оптические методы количественного определения доксорубицина.

Так как площадь внутренней поверхности мочевого пузыря составляет 380—400 см2, а доза доксорубицина — 30—50 мг, то на 1 см2 площади поверхности мочевого пузыря приходится около 0,14 мг антибиотика. Поэтому в качестве терапевтической дозы для полимерных пленок с доксорубицином была выбрана концентрация 0,14 мг/см2. Полимерами-носителями служили оксипропилметилцеллюлоза марки Methocel 65 Hg-50 (ОПМЦ), метилцеллюлоза-100 (МЦ), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ), метилцеллюлоза в сочетании с поливиниловым спиртом (МЦ+ПВС). Для дальнейших исследований были разработаны методики качественного и количественного анализа доксорубицина в пленках. Качественный анализ пленок проводили методами спектрофотомерии (по характеру спектра поглощения) и тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol UV-254. Для определения примесей и продуктов разложения были использованы следующие подвижные фазы: метанол—11% раствор аммиака (8:2); этанол—11% раствор аммиака (10:4); ацетон—бензол—вода—11% раствор аммиака (12:2:2:2); метанол—фосфатный буфер (рН=7,4)—ацетонитрил (3:5:3); а также модифицированная система нормативной документации — хлороформ—метанол—вода—11% раствор аммиака (16:6:1:1), позволяющая получать более компактные адсорбции. Детекцию проводили по собственной окраске зон и при облучении УФ-светом.
Биологическую активность доксорубицина в пленках определяли методом диффузии в агар с тест-культурой Васillus cereus var. mуcoides 537 (споры) согласно ВФС 42-1796-88 на доксорубицина гидрохлорид для инъекций. Определение антимикробной активности проводили с помощью стандартной кривой, активность антибиотика рассчитывали графическим методом. Время определения составляет 18 ч, относительная ошибка не превышает ±5%. Поскольку данный метод трудоемок, длителен и неспецифичен, был разработан спектрофотометрический метод определения доксорубицина в пленках. Спектр поглощения водного раствора доксорубицина имеет 6 максимумов при длинах волн 234, 252, 288, 334, 475, 495 нм. Для спектрофотометрического определения в качестве аналитической была выбрана длина волны 475 нм в видимой области спектра. Подчинение закону светопоглощения наблюдается при концентрациях водного раствора доксорубицина 5—50 мкг/мл. Уравнение калибровочного графика имеет вид: D = 0,0174 + 0,0183•С. В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную.
4.2 Методика количественного определения доксорубицина в пленках.
10 пленок размером 2 см2 взвешивали на аналитических весах, растворяли в 100 мл воды. Определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 475 нм на фоне воды. Время проведения анализа — 20 мин, относительная ошибка не превышает ± 3 %. Сравнительные данные микробиологического и спектрофотометрического определения приведены в табл. 1.

С целью выбора оптимального полимера-носителя антибиотика в пленках предварительно исследовали степень связывания доксорубицина с производными целлюлозы и их сочетания с поливиниловым спиртом. Для этого готовили модельные смеси (антибиотик+полимер), и через определенные промежутки времени измеряли содержание доксорубицина в полимерных растворах, используя микробиологический и спектрофотометрический методы. Связываемость антибиотика с ОПМЦ, МЦ и МЦ в комбинации с ПВС составляла не более 1—2%, что не превышает ошибки определения. В модельной смеси доксорубицина с Na-КМЦ через 3—5 мин образовывались хлопья, и изменялась окраска полученного раствора, что свидетельствует о взаимодействии антибиотика с Nа-КМЦ. Содержание доксорубицина через 30 мин снижалось на 35—40% и сохранялось на таком уровне в течение 24 ч (табл. 2).

Поэтому для дальнейших биофармацевтических исследований были приготовлены пленки с доксорубицином на основах ОПМЦ, МЦ и МЦ+ПВС. Изучение высвобождения и растворения антибиотика из лекарственных пленок проводили в опытах in vitro с использованием метода диализа через полупроницаемую мембрану (нелакированный целлофан), теста Растворение в приборе вращающаяся корзинка (2) и методом диффузии в агар по зонам угнетения роста Bacillus cereus var. mуcoides 537 (споры).
Как показали результаты исследований пленок с доксорубицином 3 методами (рис.1), наиболее полное высвобождение антибиотика наблюдалось из ОПМЦ, которая была выбрана как оптимальная основа для полимерных пленок. Поскольку процесс приготовления пленок включает стадию сушки полимерного раствора доксорубицина, при разработке технологии пленок определяли устойчивость антибиотика к температурным и временным воздействиям. С использованием спектрофотометрического и хроматографического методов анализа установлена стабильность растворов доксорубицина после нагревания при 60°С в течение 8 ч (максимальные температурный режим и время сушки пленок)(3).



Пленки готовили в асептических условиях методом полива. Так как доксорубицин легко растворим в воде, его вводили в состав полимерной композиции в виде водного раствора, который тщательно смешивали с раствором полимера и после деаэрации разливали на подложки. Высушенные пленки снимали с подложек, упаковывали в стерильные флаконы из дрота для лекарственных средств с резиновыми пробками под обкатку и хранили при температуре 4±2°С в защищенном от света месте. Свежеприготовленные пленки имели светло-оранжевый цвет, были прозрачными, гладкими, эластичными и однородными. Основные показатели качества пленок с доксорубицином (окраска, средняя масса, время растворения, значения рН водных растворов, значения Rf) через 12 месяцев хранения существенно не отличались от исходных значений. Дополнительных пятен, свидетельствующих о наличии продуктов разложения, на хроматограммах не обнаружено (табл. 3)(3).

При попадании доксорубицина в окружающие ткани во время инфузии могут развиваться некрозы и флебиты (4). В связи с этим определяли цитотоксическое действие пленок с доксорубицином в опытах in vivo. Для этого накладывали по 0,5 см2 пленки на верхнюю губу кролика в течение 5, 10, 15, 20 дней и проводили патоморфологическое исследование тканей.
Установлено, что через 5 дней эксперимента гистологическое строение базального слоя, слоя шиповатых клеток и поверхностного слоя плоских клеток эпителия губы в области аппликации пленок с доксорубицином не отличалось от такового в контроле и соответствовало норме. На 10-й день в слое шиповатых клеток эпителия губы отмечалось развитие слабо выраженной гидропической дистрофии в виде увеличения размеров отдельных клеток с появлением в их цитоплазме единичных мелких вакуолей, заполненных цитоплазматической жидкостью. При этом изменений в базальном и поверхностном слоях плоских клеток не выявлено. С 15-го дня эксперимента наблюдалось развитие более выраженной гидропической дистрофии в клетках шиповатого слоя, которая в части клеток достигает баллонной дистрофии. Наряду с этим отмечалось истончение слоя шиповатых и поверхностного слоя плоских клеток. Патологических изменений в подлежащей соединительной ткани на всех сроках эксперимента не выявлено(3).
Таким образом, в результате гистологического исследования установлено, что доксорубицин в пленках оказывает несущественное цитотоксическое воздействие на единичные клетки шиповатого слоя, которые полностью восстанавливались через 5—7 дней.(3)












Выводы


Традиционные антрациклины являются одними из наиболее эффективных препаратов для лечения солидных опухолей и онкогематологических заболеваний, однако возможности их применения ограничены из-за различных проявлений токсичности, особенно кумулятивной кардиотоксичности
Результаты фармакокинетических и фармакологических исследований подтверждают, что липосомальные антрациклины в целом хорошо переносятся и обладают более благоприятным профилем безопасности по сравнению с традиционными антрациклинами.
Исследователями разработан состав полимерных пленок с доксорубицином для местного лечения раковых опухолей слизистых оболочек. Содержание доксорубицина в пленках 0,14 мг/см2, основа - оксипропилметилцеллюлоза.
Разработаны методики качественного и количественного анализа доксорубицина в пленках. Показано преимущество разработанной спектрофотометрической методики по сравнению с предусмотренным нормативной документацией методом диффузии в агар.
Учеными разработана технология получения лекарственных пленок с доксорубицином и установлена стабильность основных показателей их качества в процессе хранения при 4±2°С в защищенном от света месте в течение 12 месяцев (срок наблюдения).
Установлено незначительное цитотоксическое действие доксорубицина в пленках на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта кролика.



ЛИТЕРАТУРА
Бордюшков Ю.Н., Сычева Е.А., Каплиева И.В. Влияние различных методов введения доксорубицина на структуру и синтетическую активность миокардиоцитов. – Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН, 2006. – 120 c.
Государственная фармакопея СССР, XI изд. — М.: Медицина, 1990. — Вып. 2. — 400 с.
Журнал "Фармация" № 3, 2005. Разработка полимерных лекарственных пленок с доксорубицином. Е.Н. Карпенко, Л.Н. Ерофеева, Л.Е. Сипливая, О.Д. Печенин, В.Т. Дудка
Машковский М.Д. Лекарственные средства / Пособие для врачей. — В 2 т., изд. 14-е, перераб., исп. и доп. — М.: ООО “Издательство Новая Волна”, 2000. — Т. 2. — 437 с.
Современная онкология: Том 08. 2006. Оценка эффективности и безопасности липосомальных антрациклинов: данные клинических исследований I-II фаз.













27