Определение морфогенетического потенциала in vitro различных родов Salvia L.

Заказать уникальную дипломную работу
Тип работы: Дипломная работа
Предмет: Биохимия
  • 2929 страниц
  • 26 + 26 источников
  • Добавлена 19.03.2014
3 000 руб.
  • Содержание
  • Часть работы
  • Список литературы
  • Вопросы/Ответы
Введение
Глава 1. Описание культуры (морфология, биология, физиология)
1.1. Морфологические особенности вегетативных и репродуктивных органов шалфея
1.2. Рост и развитие растений
2. Вторичные метаболиты (состав эфирного масла, где и как используется, для чего используют)
2.1. Химический состав масла шалфея
3. Работы с шалфеем ин витро, которые проводились ранее
Литература


Фрагмент для ознакомления

В результате этих исследований определено оптимальное количественное соотношение в надземной массе сырья листьев и стеблей (2,5:1), содержание эфирного масла максимальное.
Авторы утверждают, что в результате определено: чем больше площадь листовой пластинки и число листьев на растении, тем выше массовая доля эфирного масла. Массовая доля эфирного масла шалфея определяется количеством эфиромасличных железок и их размером.
Также, есть работы, где установлена ​​связь между массовой долей эфирного масла, числом железок и их размером. Выявлена ​​зависимость между числом железок на 1 мм2 нижней поверхности листа, величине и массовой долей эфирного масла в растении. Показано, что чем большее количество железок на 1мм2 и больше их диаметр, тем выше содержание эфирного масла [7, С. 144].
Подобную зависимость исследователи выявили и с цветках шалфея. Чем больше число железок на чашечке (на 1 мм длины межреберье) и диаметр железки, тем выше массовая доля масла в растении.
В результате изучения источниковой базы нами выявлено, что содержание эфирного масла зависит от возраста растений, а также выявлено взаимозависимость между перечисленными вышеупомянутыми признаками.
В процессе изучения динамики накопления эфирного масла исследователи обнаружили, что максимальное его количество достигало в фазе массового цветения - до 1,8 % на сухое сырье. Далее в фазе конца цветения наблюдается некоторое снижение до 1,5%, а в фазе созревания семян началось заметное снижение содержания эфирного масла до 1,3 % на сухое вещество. Снижение масла объясняется усиленным ростом цветоносного побега и увеличением его массы в сырье, а цветонос является балластом, поскольку содержит лишь следы эфирного масла. В фазе плодоношения продолжалось снижение содержания эфирного масла до 1,14 % на сухое вещество.
Как выяснилось, такая закономерность характерна для растений Salvia разного возраста и не зависит от количества лет жизни.
Изучение компонентного состава эфирного масла семенной популяции шалфея дало основания для вывода, что внутривидовой состав ее надземной массы достаточно разнообразен и состоит из следующих основных компонентов: α - и β - туйон, 1,8 - цинеол, камфора, борнеол, α - и β - пинены, кариофилен и сесквитерпены. Выявлено 28 монотерпенов соединений, идентифицировано 26 терпеноидов [3, С. 255].
Анализ работ по изучению состава эфирного масла шалфея показал, что в семенном потомстве шалфея наблюдалась значительная изменчивость по составу эфирного масла. Основная часть растений (75%) синтезировала туйон, камфару, цинеол, борнеол, пинен, камфен, мирцен и в незначительных количествах другие компоненты. Эта группа растений синтезировала, в основном, α - и β - туйон ( 50 %), цинеол (до 8 %), камфору (до 15 %), борнеол (до 5 %) [2, С. 203].
Сравнительное изучение биосинтеза терпеноидов у растений Salvia показало, что по мере старения (8- и и 10 - и летние растения) происходит снижение биосинтеза 1,8 - цинеола, α - туйона, α - пинена, борнеола [9, С. 274].
Доминирующими компонентами эфирного масла являются туйона (42% ), цинеол (21,6 %), борнеол ( 11,4 %), камфора ( 10,6 %). Таким образом, биосинтез камфоры, β - туйона и особенно сесквитерпенив по мере увеличения возраста растения (8-й год жизни) имеют тенденцию к увеличению. Оптимальными по качественному составу эфирного масла является 4-летние растения.
Анализ работ по изучению компонентного состава эфирного масла шалфея в вегетативных и генеративных органах показал, что все органы шалфея содержат эфирное масло. Наибольшая ее количество содержится в листьях, несколько меньше в соцветиях, еще меньше в стеблях и минимальная в корнях растений. Доминантным компонентом является α - и β - туйона , массовая доля которых составила 36,0 %, далее идет 1,8 - цинеол ( до 21,6 %) [11, С.244].
Состав эфирного масла из стеблей шалфея немного отличался от состава масла надземной массы. Основной компонент - α - туйон, массовая доля которого составляет около 32 % , β - туйон - 18%. Камфора и 1,8 - цинеол - 7,51 % и 5,25 % соответственно. Сумма сесквитерпеновые составляет 25 %. Следует отметить, что в стеблях находится низкое содержание углеводородов - α - пинен , камфен , β - οинен и мирцен , спирт борнеол составил 3,31 %.
Таким образом, в ходе научно-теоретичного анализа источников по исследованию эфирного масла шалфея установлено, что растение содержит масло во всех органах растения (корень, стебель, листья и соцветия). Анализ химического состава показал, что эфирное масло шалфея содержит в своем составе углеводороды, спирты, кетоны, сложные эфиры борнилацетат. Изучение результатов газожидкостных хроматографий доказывает, что в состав эфирного масла входит 28 терпеновых соединений. Кроме этого, в составе эфирного масла также определяются цинеол, туйон, пинен, камфен, борнеол, камфора.
Так, сравнительный анализ результатов исследований эфирного масла позволил обнаружить разницу в количественных показателях соединений в различных органах растений.


3. Работы с шалфеем ин витро, которые проводились ранее
Разработка клеточных технологий является важной частью современной селекции, поскольку способствует повышению эффективности и ускорению селекционного процесса. Биотехнологические методы позволяют создавать уникальные генотипы, которые часто невозможно получить, используя традиционные методы, быстро размножать ценные образцы, а также получать оздоровленный посадочный материал, создавать коллекции in vitro.
Анализ исследований шалфея in vitro показал, что за последние годы получено теоретических и практических результатов, разработаны более пятидесяти новых методик, авторами получены патенты на изобретения [1, С. 42].
Основными направлениями исследований in vitro являются:
- изучение биологии культивируемых клеток и тканей in vitro, в том числе особенностей индукции каллусогенеза, органогенеза и соматического эмбриогенеза, а также закономерностей изменчивости популяций соматических клеток в изолированной культуре;
- получение новых генотипов на основе сомаклональной вариабельности и мутагенеза in vitro связано с разработкой методов индукции морфогенеза и регенерации растений в каллусных культурах. Получено более 1000 регенерантов из каллусов разных пассажей лаванды, шалфея, кориандра, фенхеля, аниса, тысячелистника, герани, полыни, среди которых выявлена изменчивость по морфологии, числу хромосом и хозяйственно ценным признакам. Выделены и включены в селекцию перспективные формы, превышающие исходные сорта на 20-60% по урожайности и содержанию эфирного масла;
- клеточная селекция in vitro на устойчивость к абиотическим стрессовым факторам среды позволяет проводить отбор устойчивых генотипов с использованием каллусов и изолированных зародышей. Для шалфея разработаны селективные системы, позволяющие отбирать формы, устойчивые к низким температурам, солевому и осмотическому стрессу; получены устойчивые клеточные линии и регенеранты;
- клональное размножение в культуре изолированных меристем - важнейшее прикладное направление работы. Разработаны способы микроразмножения in vitro для шалфея (с коэффициентом размножения 1:9 - 1:68 за цикл), которые позволяют ускоренно размножать ценные генотипы, быстро внедрять в производство новые сорта и получать качественный посадочный материал. Проводятся исследования по разработке методов создания коллекций ценных генотипов in vitro на основе длительного хранения меристем и микрочеренков при низкой положительной температуре;
- культура гибридных зародышей позволяет преодолеть несовместимость при отдаленной гибридизации и получить потомство от ранее не удававшихся скрещиваний. Получено более 700 гибридов шалфея по 50 комбинациям скрещивания. Среди межвидовых (Salvia sclarea х S. scabiosifolia, S. grandiflora, S. aethiopis) и межсортовых гибридов шалфея выделены образцы, превышающие исходные сорта в 1,3-1,7 раз по сбору эфирного масла и содержанию склареола;
- исследование клеточных культур in vitro как источников продуктов вторичного метаболизма (эфирного масла, пигментов, фенольных соединений) у шалфея - позволяет использовать их в качестве модельных систем для изучения закономерностей биосинтеза этих веществ, а также для разработки альтернативных биотехнологий их получения in vitro [4, С. 85; 6, С. 36; 12, С. 95].
Анализ литературных источников показал, клональные размножения шалфея ранее не проводились.
Для введения в стерильную пробирочную культуру in vitro исследователи ботанического сада имени Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета использовали осенние побеги растений. В качестве первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий пазушные почки, из которых после введения происходило развитие побегов.
Стерилизацию побегов проводили по такой схеме: побег вводимого растения аккуратно мыли под проточной водой мягкой губкой с ПАВ содержащим моющим средством. Затем обрезали листья на половину длины черешка и нарезали побег на сегменты, удобные для дальнейшей отмывки [1, С. 44].
Полученные участки стебля с междоузлиями помещали в стеклянную емкость, заливали водопроводной водой, добавляли каплю ПАВ содержащего моющего средства, накрывали марлей и качали на качалке 10 минут. После этого материал ставили под проточную воду, не снимая марли, на 20 минут. По истечении этого времени в емкость с побегами заливали дистиллированную воду и снова качали 10 минут. Следующие этапы проводили в стерильных условиях: материал подвергали обеззараживанию в стерилизующих растворах, после чего троекратно по 5 минут отмывали в стерильной дистиллированной воде на качалке.
Для обеззараживания первичных эксплантов поверхностную стерилизацию проводили тремя способами. В первом случае материал помещали на 25 минут в раствор гипохлорита натрия и стерильной дистиллированной воды в соотношении 1:3 соответственно.
Второй способ отличается тем, что в растворе гипохлорита натрия той же концентрации, что и в предыдущем варианте, экспланты находились 20 минут, после чего их погружали в 70%-й спирт на 10 секунд. В третьем случае использовали 4% раствор гипохлорита натрия, содержащий 0,04%-й мертиолята и стерилизовали 20 минут.
После поверхностной стерилизации все экспланты помещали в пенициллиновые пузырьки на полную по макросолям среду Мурасиге и Скуга [22, С. 473] с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП).
Для мультипликации образовавшиеся из пазушных почек регенеранты в ламинаре отделяли от первичного экспланта и помещали на половинную по макросолевому составу среду WPM с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л гиббереловой кислоты (ГА3).
В некоторых случаях от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов от первичных эксплантов, удавалось избавиться обработкой их раствором бензилпенициллина натриевой соли (1000000 ед./500 мл воды: содержимое одного пузырька антибиотика в 500 мл стерильной дистиллированной воды) в течение 15 минут.
В культуру in vitro шалфей вводили осенними побегами, срезанными с растений, культивируемых в условиях открытого грунта в ботаническом саду Воронежского государственного университета.
Исходный материал для введения в стерильную культуру in vitro отличался высоким уровнем внешней и внутренней естественной инфекции. Возможно, это связано с тем, что растения были срезаны в осенний период. Поэтому были опробованы три способа стерилизации. Наблюдения показали, что стерилизующий раствор с 4%-м гипохлоритом натрия и мертиолятом малоэффективен, так как все вводимые побеги в довольно короткий срок (5-6 суток) пропали от развития внутренней бактериальной инфекции. Экспланты, введенные с использованием метода стерилизации гипохлорит натрия со спиртом, выглядели лучше всего, но в базальной части также была инфекция. Метод стерилизации с использованием только гипохлорита натрия в большой концентрации дольше всего не давал проявляться колониям бактерий, что позволило получить регенеранты из пазух листьев и отделить их от первичных эксплантов [1, С. 42].
Таким образом, типом первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий почку и около сантиметра стебля вверх и вниз от почки. Вводимые экспланты помещали в вертикальном положении на полную по солевому составу среду WPM с добавлением 1 мг/л 6-БАП. На этой среде из пазушных почек быстро начинали развиваться побеги - регенеранты, поэтому она оптимальна для развития уже имеющихся меристем.
Авторы отмечают, что длительное культивирование растений становится обводненным и растения могут потерять способность к размножению и корнеобразованию, а впоследствии погибнуть.
В результате от пятнадцати первичных эксплантов было получено всего три регенеранта, вследствие чего оказалось актуально увеличение их количества с помощью микрочеренкования.
Отделенные побеги помещали в пенициллиновые пузырьки со средой WPM половинной по макросолевому составу (1/2 WPM) с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ГА3, поскольку она подходит для мультипликации и вытягивания образующихся адвентивных побегов. Для избавления их от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов, качали на качалке в растворе бензилпенициллина и пересаживали на свежую среду того же состава.
Депонирование in vitro проводили с периодическими пересадками на свежую среду, чтобы избежать высыхания и изменения состава среды вследствие жизнедеятельности растений [21, С.421].
Нами проанализированы работы по корнеобразованию in vitro. Авторы Вепринцев В.Н., Карпеченко Н.А. в исследованиях показали, что регулярная пересадка эксплантов в свежую среду, способствует образованию корней в базальной части либо из небольшого каллуса, либо непосредственно на месте среза. Укоренение in vitro происходит не ранее, чем через месяц поддержания стерильной культуры [15, С. 143].
Таким образом, получение укорененных in vitro растений шалфея позволяет проводить дальнейшие исследования в природных условиях. Сначала они должны пройти период адаптации к почвенным условиям в закрытом грунте, после чего смогут расти в открытом грунте.
К преимуществам данного способа размножения авторы относят возможность размножения растений шалфея круглый год, поддержание и сохранение в виде растущей культуры в трудные периоды, простоту передачи и обмена растениями между лабораториями и конечными получателями продукции, возможность быстрого и масштабного тиражирования культур, получение чистого безвирусного исходного растительного материала для дальнейших интродукционных работ.
Как видим, исследования в области шалфея позволили разработать метод микроклонального размножения шалфея. В ходе исследований учеными был подобран оптимальный режим стерилизации, солевой и гормональный состав питательных сред для депонирования, мультипликации и корнеобразования эксплантов шалфея. Полученные укоренившиеся в культуре in vitro растения, пригодные для адаптации к природным условиям.













29

1. Бутова Г.П., Табацкая Т.М., Скробова Л.Л. Использование методов культуры ткани для размножения и генетического улучшения селекционного материала лесных древесных растений Центральный научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции // Генетика и селекция в лесоводстве. – М., 1991. – С. 41–49.
2. Байков К.С. Salvia L. – Шалфей // Флора Сибири. Новосибирск, 1997. - Т. 11. - С. 201–202.
3. Бодруг М.В., Петров Г.Я. Некоторые химические данные о составе эфирного масла из дикорастущих видов Salvia L. в Молдавии // Раст. Ресурсы, 1970. - Т. 6. - Вып. 2. - С. 250–255.
4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Учебное пособие. – М.: ФБК – ПРЕСС, 1999. – 160 с.
5. Гроссгейм А.А. Лекарственные растения Кавказа. - Баку, 1943. - 78 с.
6. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений.– К.: Наук. думка, 1980. – 488 с.
7. Ковалев В.М. , Павлий О.И , Исакова Т.И. Фармакогнозия с основами биохимии растений. - Харьков : УкрФА , 2000 . - 703 с .
8. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. – 10-е изд. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2006. – 600 с.
9. Мазнев Н. И. М 13 Энциклопедия лекарственных растений. 3- е изд. , Испр . и доп . - М. : Мартин . 2004 . - 496 с .
10. Муравьева Д. А. Фармакогнозия : Учебник. - 3-е изд . , Перераб . и доп . - М.: Медицина , 1991 . -560 С. : ил . - ( Учеб. лет . Для студ. Фарм . Ин -тов)
11. Победимова Е.Г. Род Шалфей – Salvia L. // Флора СССР. - М., Л., 1954.- Т. 21. - С. 244–363.
12. Селекция эфиромасличных культур (Методические указания) / [под ред. проф. А.И. Аринштейн] – Симферополь, НПО «Эфирмасло», 1977. – 150 с.
13. Фармакогнозия. Атлас: Учеб . пособие / Под ред . М. И. Гринкевич , Е. Я. Ладыгина . - М. : Медицина, 1989 . - 512 с . : Ил . - ( Учеб. лет . Для студ. Мед . Ин- тов. Фарм . Фак . ) .
14. Фармакогнозия: Учебное пособие / Попова Н.В. , Городнянская Л.М. , Сербии А.Г. , Ковалев В.Н. - Харьков : УкрФА , 1999 . - 318с .
15. Федорчук М.И., Плоткин С.Я., Куценко Н.М. Влияние зоны выращивания шалфея лекарственного на содержание эфирного масла в надземной части растения // Изучение онтогенеза растений природных и культурных флор в ботанических учреждениях и дендропарках Евразии / Матер. 11 Междунар. наук. конф. - Белая Церковь, 1999. - С.141-145.
16. Флора СССР. Т. XXI. Губоцветные (вторая часть) [под ред. В.Л. Комарова]. – М.-Л.: Изд-во Ботанического института академии наук СССР, 1954. – 366 с.
17. Ходжиматов К.Х. Исследования шалфея мускатного и шалфея пустынного в УзССР //Актуальные проблемы изучения эфирномасличных растений и эфирных масел. - Кишинев, 1970. - С. 68–70.
18. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения. / Под ред . Яковлева Г.П. , Блиновой К.Ф. - С. Пб.: Специальная литература, 1999 . - 996 с .
19. Joulain D., Kunig W.A. Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons. - Hamburg, 1998. - 658 p.

20. Li Xi-wen, Hedge I.C. Salvia L. // Flora of China. 1994. Vol. 17. P. 195–222.
21. Lloyd G., McCown B. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot-tip culture // Proc. Int. Plant Prop. Soc. – 1981. – Vol. 30. – P. 421–437.
22. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. – 1962. – Vol. 15. – P. 473–497.
23. Murthy B. N. S., Singh R. P., Saхena Praveen K. Induction of high-frequency somatic embryogenesis in geranium (Pelargonium х hortorum Bailey cv. Ringo Roso) cotyledonary cultures. // Plant Cell Repts. – 1996. – 15, № 6. – P. 423-426.
24. Murthy H.N., Hahn E.J., Paek K.Y. Recurrent somatic embryogenesis and plant regeneration in Coriandrum sativum L. // Scientia Hort. – 2008. – V.118, N2. – P.168-171.
25. Skala E., Wysokinska H. In vitro regeneration of Salvia nemorosa L. from shoot tips and leaf explants // In vitro Cell. Dev. Biol.– Plant. – 2004. – V.40, N 6. – P. 596-602.
26. Tsuro M., Inoue M., Kameoka H. Variation in essential oil components in regenerated lavender (Lavandula vera DC) plants // Scientia Hort. – 2001. – V.88, N4. – P.309-317.

Вопрос-ответ:

Каковы морфологические особенности вегетативных и репродуктивных органов шалфея?

Вегетативные органы шалфея представлены прямостоячими стеблями с противоположными листьями. Листья имеют длину до 10 см и яйцевидную форму. Они покрыты мельчайшей войлочной пушинкой, что придает им серебристый оттенок. Репродуктивные органы шалфея включают цветки, собранные в соцветия. Цветки имеют различные оттенки: от голубого до фиолетового и белого.

Как происходит рост и развитие растений шалфея?

Рост и развитие растений шалфея начинается с появления проростка из семени. Затем образуется корневая система, которая обеспечивает питание и воду растения. Следующим этапом является развитие стебля и листьев. При наличии определенных условий, растение шалфея может цвести и образовывать плоды.

Каков химический состав масла шалфея?

Химический состав масла шалфея может варьировать в зависимости от вида и сорта растения. Однако, основными компонентами эфирного масла шалфея являются тульса (около 30-40%), диканнол (около 15-25%), α-тульпинен (около 10-15%) и гамма-тульпинен (около 5-10%). Они придают маслу шалфея его характерный запах и полезные свойства.

Какие исследования проводились с шалфеем в vitro?

В литературе описаны различные исследования морфогенеза шалфея in vitro. Они включают культурные методы, такие как каллюсная и органогенезирующая культура, с использованием различных фитормонов. Такие исследования были проведены с целью изучения возможностей получения биомассы и вторичных метаболитов в vitro, а также для установления оптимальных условий для роста и развития растений шалфея.

Какую информацию можно найти в литературе о шалфее и его использовании?

В литературе можно найти информацию о различных аспектах использования шалфея. Это может быть информация о его медицинских свойствах, использовании в кулинарии или в косметологии. Также в литературе описываются результаты исследований по выращиванию шалфея и получению эфирного масла. Эта информация может быть полезна для тех, кто интересуется использованием шалфея в различных областях.

Какие морфологические особенности имеют вегетативные и репродуктивные органы шалфея?

Вегетативные органы шалфея имеют форму прямостоячих стеблей, листьев и корней. Репродуктивные органы представлены цветками, включающими в себя чашелистики, венчик, тычинки и пестик.

Каков состав эфирного масла шалфея и для каких целей его используют?

Состав эфирного масла шалфея включает в себя различные активные вещества, такие как туяновые кислоты, ациклические моно- и сесквитерпены (такие как салвинал, туяловый спирт, бета-линалулол) и прочие соединения. Это масло широко используется в косметической и фармацевтической промышленности, а также в ароматерапии.

Какие работы с шалфеем ин витро проводились ранее?

Литературные данные описывают различные исследования, включающие получение культур шалфея in vitro, определение оптимальных условий для их роста и развития, а также изучение физиологических и биохимических характеристик растений, полученных в процессе культивирования in vitro.

Какие морфологические особенности имеют вегетативные органы шалфея?

Вегетативные органы шалфея (род Salvia L.) представлены листьями и стеблями. Листья шалфея имеют длину от 2 до 8 см, расположены противостоячно на стебле и имеют яйцевидную или овальную форму. Они покрыты маленькими волосками, которые придают им серебристый оттенок. Стебли шалфея прямые, цилиндрические или угловатые, высотой от 20 см до 90 см, ветвистые или неветвистые. Они также покрыты мелкими волосками и могут быть зеленого, фиолетового или красноватого цвета.