Биотехнология получения стероидных гормонов

Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем. Последние приемы обработки готового технического продукта обычны для технологии получения многих органических веществ и лекарственных препаратов. Получение чистых лекарственных форм гидрокортизона проводится традиционными методами.Трансформация гидрокортизона в преднизолонВыращивание трансформирующей культуры М. gtobiforme осуществляется такими же последовательными этапами и в тех же аппаратах при тех же условиях аэрации и перемешивания, далее проводится трансформация гидрокортизона с помощью названной дегидрирующей культуры. Выделение готового продукта - преднизолона, осуществляется также путем экстракции-сепарации из культуральной жидкости, отличаясь лишь набором растворителей.В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использования мелкокристаллических стероидных субстратов. Микронизация субстрата до размеров частиц в несколько микрометров и внесение в ферментационную среду без растворителя позволяет повысить исходную концентрацию стероидного субстрата до 20-50 г./л. [18]2.5. Трансгенные микроорганизмы для биотехнологического получения стероидовТехнология промышленного получения стероидных гормонов и лекарственных средств на их основе включает в качестве начальной стадии микробиологическую трансформацию одного из природных стеринов (холестерина, эргостерина, β-ситостерина). При этом происходит полная деградация боковой цепи и образуются андрогены (андростендион и андростендиендион), которые в после дующих химико-ферментативных стадиях превращаются в соеди нения, дающие начало всему спектру стероидных гормонов (минералкортикоидов, глюкокортикоидов, половых гормонов). Использование трансгенных микроорганизмов, синтезирующих белки, которые обеспечивают синтез стероидных гормонов, может позволить получать прегнаны путем микробиологической биотрансформации с проведением нескольких реакций в одну технологическую стадию, что принципиально меняет технологию производства конечных стероидных препаратов. Важным условием для выбора оптимального реципиента для молекулярного клонирования является определение базовой активности микроорганизмов в отношении стероидов и установление состава белковых компонентов микроорганизмов, которые могут являться редокс-партнерами цитохромов Р450. При этом следует учитывать, что наличие собственных ферментов, способных осуществлять модификацию стероидных субстратов, может приводить к образованию желательных или нежелательных побочных продуктов .Для создания рекомбинантных штаммов микроорганизмов, способных осуществлять метаболические процессы трансформации стероидов, необходимо обеспечить введение в клетки-реципиенты нескольких генов, кодирующих белки одной или нескольких многокомпонентных систем. В литературе описаны различные методические подходы,разработанные для осуществления коэкспрессии белков. Известно, что природные стероидтрансформирующие ферментные системы обладают относительно низкой функциональной активностью . Идея создания слитых моно оксигеназных систем, объединяющих в составе одной полипептидной цепи все компоненты, необходимые для катализа, возникла после того, как были обнаружены природные «слитые» монооксигеназы, в частности, бактериальный цитохром Р450–ВМ3, демонстрирующий очень высокую каталитическую активность . Обнаружение природных прототипов послужило стимуломк созданию двухкомпонентных (микросомальных) и трех-компонентных (митохондриальных) слитых монооксигеназв надежде на то, что в пределах единой молекулы будет происходить более эффективный перенос электронов между белками-партнерами.Исследования двухкомпонентных слитых монооксигеназ показали, что в слитых белках может осуществляется более эффективное взаимодействие компонентов в сравнении с системами, в которых активность обеспечивается независимым взаимодействием отдельных компонентов. кроме того показано, что с целью получения максимально активных вариантов слитого белка можно изменять взаимное расположение доменов и междоменных линкеров . Выводы, касающиеся соотношения активности трехкомпонентных систем и слитых монооксигеназ, также различны. В развитие биотехнологии в дрожжах S. cerevisiae были реконструированы две начальных стадии стероидогенеза млекопитающих, которые осуществляются системой отщепления боковой цепи холестерина с цитохромом Р450scc и 3β-ГСД. В ходе обозначенных опытов, был реконструирован наиболее сложный на сегодняшний день метаболический путь в эукариотическихмикроорганизмах. Другими словами, был создан биосинтетический аналог коркового слоя надпочечной железы млекопитающих. Безусловно, эта работа является выдающимся достижением в области метаболической протеомики. Тем не менее, это не означает, что создание новых, еще более эффективных трансгенных микроорганизмов нецелесообразно.Пути открыты в направлении поиска микроорганизмов-реципиентов, адаптированных к трансформации гидрофобных соединений, и по линии упрощения генно-инженерных манипуляций.ЗаключениеВнедрение микробиологического синтеза в процессы получения стероидных гормональных препаратов вызвало переворот в фармацевтической промышленности, позволив сразу во много раз удешевить ценные препараты.Метод микробиологических превращений открывает возможность тонких перестроек сложных молекул, удобство технологических процессов. Дело в том, что сложность и громоздкость молекул стероидов затрудняет даже незначительные модификации их химическим путем. Микроорганизмы могут осуществлять уникальные реакции в синтезе лекарственных препаратов стероидной природы, а именно 1,2 - дегидрирование, 11-гидроксилирование.Промышленный синтез таких важнейших лекарств, как гидрокортизон, преднизон, преднизолон, дексаметазон стал возможен только после разработки микробиологических способов их получения. Эти препараты широко применяются при лечении тяжелых ревматических заболеваний, бронхиальной астмы, воспалительных процессов и хронических кожных заболеваний.Вместе с тем отметим, что традиционные методы получения стероидных гормонов (экстракция из растений и тканей животных, полный химический синтез, химико-ферментативный синтез) сделали доступными для медицинского применения широкий спектр лекарств, но в настоящий момент практически исчерпали свой потенциал с точки зрения промышленной технологии. Принципиально новой технологией в области синтеза субстанций лекарственных соединений можно считать использование трансгенных микроорганизмов, полученных с помощью техники рекомбинантных ДНК. Здесь сочетаются биотехнологические преимущества ферментативных трансформаций и возможность создания аналогов, моделирующих пути биосинтеза гормонов в стероидогенных тканях млекопитающих, включая человека. Предварительным этапом работ по конструированию таких рекомбинантных микроорганизмов являются исследования, включающие экспрессию и изучение свойств белков стероидтрансформирующих систем в разных организмах-хозяевах, позволяющие оценить возможность приобретения белками нативных свойств в чужеродной среде и выбрать лучший микроорганизм-реципиент. С этой целью в ряде работ использованы системы гетерологической экспрессии бел ков, вовлеченных в процесс стероидогенеза млекопитающих, на основе клеток дрожжей и бактерий.В заключение отметим, что в промышленном производстве стероидных препаратов биотехнологические методы имеют конкретные преимущества перед методами химического синтеза: возможность химических реакций, недоступных для химического синтеза, превращение субстрата в биологически активную форму соединения в течение одной стадии процесса (в отличие от многостадийного и весьма затратного химического синтеза), а также экономичность и экологичность производства.Список литературыАндрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Скрябин К.Г. и др. Штамм бактерий Mycobacteriumneoaurum и способ его использования для получения андрост-4-ен-3,17-диона из стеринов растительного и животного происхождения. // 2004 Патент РФ № 2231553. Кл. С12Р 33/00.Ахрем А.А., Титов Ю.А. Полный синтез стероидов. 1967. - 306с Безбородов А.М. Биотехнология продуктов микробного синтеза. - М.: ВО Агропромиздат, 1991. - 354 с.Биотехнология / под ред. А.А. Баева. - М.: Наука, 1984. - 432 с.Биотехнология лекарственных средств: учебное пособие под ред. В.А. Быкова, М.В. Данилина. - М.: «Медбиоэкономика», 1991. - 303 с Биотехнология: принципы и применение / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джойса; пер. с англ. - М.: Мир, 1998. - 485 сБиотехнология: учебное пособие для студентов высших учебных заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. - 3-е изд., стер. - М.: «Академия», 2008. - 256 сГилевич С.Н., Гурьев О.Л., Шкуматов В.М., Чащин В.Л., Ахрем А.А. Биохимия, 1987. - №52.- С. 198–213.Дружинина А.В.. Применение полимеров в микробиологических трансформациях стероидов : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.06 / Дружинина Анна Викторовна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова].- Москва, 2010.- 116 с.Друца В.Л., Исаева Л.В., Черноголов А.А., Усанов С.А., Лузиков В.Н. Биохимия. -1997. - № 62. - С. 908–916.Зейналов О.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — №1. — 2005. — С. 32–36.Карпова Н.В. Экспериментальный подход к получению базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов [Текст] : автореферат дис. ... канд. биол. наук : 03.02.03 / Н. В. Карпова ; Российский ун-т дружбы народов г.Москва. - М., 2014. - 23 с.Лещинская И.Б. Современная промышленная микробиология // Биология. Соровский образовательный журнал. 2010. http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/972.htmlНовикова Л. А., ФалетровЯ. В., КовалеваИ. Е., МауерсбергерШ., Лузиков В. Н., Шкуматов В. М. От структуры и функции ферментов биосинтеза стероидов к новым генно-инженерным технологиям // Успехи биологической химии. - т. 49. – 2009. - с. 159–210Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР / Под ред. А. М Шамина. - М.: Наука, 1998. - 287 сРуководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 сСазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Катлинский А.В. (ред.) Биотехнология Учебное пособие для студентов высших фармацевтических учебных заведений. / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И.Чакалева ; под ред. А. В. Катлинского. — 3-е изд., стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2008. — 256 с.Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. - М.: Мир, 1987. - 389 сФизер Л., Физер М. Стероиды 4-е изд., Пер. с англ. - М.: Мир, 1964. - 982 с.Филиппович Ю. Б.Основы биохимии: Учеб. для хим. и биол. спец. пед. ун-тов и ин-тов. - 4-е изл.,перераб. и доп. - М.: изд-во "Агар", 1999.-512 с.