Получение инсулина,методами генной инженерии

При этом в составе гибридного белка оба эти компонента могут присутствовать одновременно. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности ‒ присутствия нескольких копий целевого полипептида в гибридном белке, что позволяет существенно повысить выход целевого продукта.
В Великобритании синтезированы обе цепи человеческого инсулина с помощью E.coli, соединенные в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
В Институте РАН с использованием генно-инженерных штаммов E.coli получен рекомбинантный инсулин. Из выращенной биомассы выделяется гибридный белок-предшественник, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ хромотографических очисток получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.
Для получения инсулина используют штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, состоящий из линейного проинсулина и фрагмента белка А Staphylococcus aureus, присоединенного к его N-концу через остаток метионина [8, 9, 10].
Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
Возможен и другой путь: получение в бактериальной системе экспрессии рекомбинантного белка, состоящего из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют с использованием хелатной хроматографии на колонках с Ni-агарозой и расщеплением бромцианом.
Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) высокоэффективной жидкостной хроматографией, показывают наличие дисульфидных мостиков, которые соответствуют дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получать белок, состоящий из присоединенного к N-концу проинсулина через остаток лизина лидерного пептида интерлейкина 2. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок с получением инсулина и С-пептида расщепляется трипсином [5, 8, 10].
Полученные инсулин и С-пептид очищаются ОФ ВЭЖХ. Весьма существенным при создании слитых конструкций является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином, соединяются по принципу "голова-хвост". ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
Заключение
Радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом до настоящего времени служит инсулин. До получения и внедрения инсулина в клиническую практику в течение одного-двух лет с начала заболевания больных сахарным диабетом I типа ждал летальный исход, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные сахарным диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение регулярного введения инсулина в силу тех или иных причин ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
В настоящее время по распространенности сахарный диабет находится на III месте после заболеваний сердечно-сосудистой системы и злокачественных опухолей. Распространенность сахарного диабета среди взрослого населения, по данным Всемирной организации здравоохранения, в большинстве регионов мира составляет 2-5 % и имеет тенденцию к увеличению каждые 15 лет количества больных почти в два раза. Численность инсулинзависимых больных, несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек.
Наиболее перспективными методами получения инсулина являются методы генной инженерии. Генно-инженерный инсулин получают раздельным получением цепей А и В с использованием разных штаммов-продуцентов и последующим фолдингом молекулы, с последующим разделением изоформ, и синтез в клетках E.Coli проинсулина с его расщеплением трипсином и карбоксипептидазой и получением нативный инсулина.
Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России для спасения жизни миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.
Литература
Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г.Л. Вышковского.-2005.- М.: РЛС-2005, 2004.- 960 с.
Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. ... канд. биол. наук – М, 2003г.
Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 - 23, № 2
Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology. — М.: Мир, 2002. — С. 517-532. — 589 с.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.
Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.-М.: Мир.- 1984.- 176 с.
Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. - 118 с.
Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.
Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.
Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.] // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23
Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. - 2002. - 522 с.
Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.
Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. – 2-е, изд., испр. и доп. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496 с.
http://www.biotechnolog.ru/ge/ge3_1.htm
http://microbiologu.ru
http://www.mikrobiki.ru
www.gmo-compass.org
Приложение


Рис. 1. Схема расположения дисульфидных связей в молекуле инсулина.

Рис. 2. Схема расположения аминокислотных остатков в молекуле инсулина
Влияние инсулина на ключевые ферменты метаболизма
Печень Мышцы Жировая ткань   Активация   1 . Фосфодиэстераза 1 . Фосфодиэстераза 1 . ЛП-липаза 2. Фосфофруктокиназа 2. Фосфофруктокиназа 2. Фосфофруктокиназа 3. Пируваткиназа 3. Пируваткиназа 3. Пируваткиназа 4. Пируватдегидрогеназный комплекс 4. Пируватдегидрогеназный комплекс 4. Ацетил-КоА-карбоксилаза 5. Фосфатаза гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы 5. Фосфатаза гликогенсинтазы   б.Ацетил-КоА-карбоксилаза       Индукция   1 . Глюкокиназа   1 . Глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа 2. Цитратлиаза   2. Пальмитатсинтаза 3. Пальмитатсинтаза     4. Пируваткиназа     5. Ацетил-КоА-карбоксилаза     6. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа       Репрессия   Фосфоенолпируваткарбоксикиназа    

Рис. 3 Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерганса. ЭР – эндоплазматический ретикулум. 1 – образование сигнального пептида; 2 – синтез препроинсулина; 3 – отщепление сигнального пептида; 4 – транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 – превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 – секреция инсулина и С-пептида.



























Рис. 4. Общая схема синтеза инсулина из его предшественников



Рис. 5 Синтез инсулина с помощью образования двух раздельных цепей












18