Капиллярный электрофорез

Отсюда видно, что вкладом перегрузки по объему пренебречь нельзя. Даже при маленькой концентрации в области, в которой можно пренебречь перегрузкой по массе, значение Н остается при вводе пробы за 5 с больше, чем при вводе за 1 с.

Глава 2. Аппаратура
Отдельные приборы принципиальных различий не имеют, так как сами системы разделения очень просты. Различия связаны с вводом пробы, а также числом и видом предлагаемых детекторов. [5]
2.1. Источники напряжения
Напряжение должно регулироваться в области от -30 кВ до +30 кВ и при заданном значении по возможности оставаться постоянным. Максимально допустимый ток составляет 250 мкА, применение больших значений на практике нецелесообразно. Кроме того, оказалось выгодным, если или напряжение, или ток могли бы поддерживаться постоянными независимо друг от друга.[5] Автоматическая переполюсовка источника напряжения необходима только тогда, когда последовательность проб нужно обработать с помощью различных методов анализа и с применением по-разному ориентированного электрического поля.
2.2. Капилляры
В КЭ обычно применяются кварцевые капилляры диаметром от 50 мкм до 100 мкм. Возможно также применение стеклянных и пластиковых капилляров, которые, однако, не обладают достаточной проницаемостью в коротковолновой УФ-области. Полиамидный слой кварцевого капилляра перед применением должен быть удален на месте детектирования механически или с помощью выжигания. В большинстве случаев используются необработанные и немодифицированные капилляры. Кварцевые капилляры разных фирм различаются по точности непостоянству внутреннего диаметра, а также обработке внутренней поверхности и оптической проницаемости в области коротких волн. По этой причине для полного гидроксилирования поверхности новые капилляры перед их первым употреблением должны обрабатываться в течение 10 минут 1М раствором NaOH и затем выдерживаться примерно 20 минут в разделительном буфере. В КЭ типичный вводимый объем находится в пределах между 2 и 20 нл, так что при объеме пробы 1 мкл возможно многократное впрыскивание. Раствор пробы после анализа с помощью КЭ может использоваться для дальнейших исследований.[5]
Глава 3. Количественный анализ

На воспроизводимость получаемых результатов влияет множество факторов: разница в электропроводности между разделительным электролитом и раствором пробы, большое различие в концентрации компонентов пробы и их электрофоретическая подвижность, различие в составе пробы.[9] С другой стороны, преимущества КЭ проявляются тогда, когда необходимо проанализировать очень малые объемы проб. Миниатюризация ввода пробы в коммерческих приборах, прогрессирует так сильно, что из общего объема пробы 3 мкл в автоматизированных приборах можно сделать множество вводов. Однако при этом не исключено, что состав пробы во время ввода изменится. Причина заключается в занесении буфера в пробу или в селективном вводе определенных компонентов пробы при электрокинетическом вводе. Работа со столь малыми объемами затруднена, если объем пробы в автозагрузчике может изменяться за счет испарения. Эти эффекты можно уменьшить при помощи охлаждения пробы или использования герметичного затвора в сосуде для пробы. Если необработанные данные анализа представлены в форме хроматограмм, то количественные результаты анализа получают или определением высоты пиков, или после интегрирования в виде площади пиков. Только в области определения примесей количественное выражение их концентрации через высоту более надежно, чем через площадь пика. Этому есть две причины: первая заключается в том, что при анализе примесей высота пика пропорциональна их концентрации, так как эффекты насыщения и перегрузки можно исключить, а вторая заключается в том, что ошибка автоматизированного определения высоты в этом случае меньше, чем при интегрировании пиков. Как только высота пиков возрастает, интегрирование становится рациональным и необходимым.
При КЭ, в отличие от ВЭЖХ, пробы перемещаются мимо детектора не с одинаковыми скоростями. По этой причине компоненты пробы с одинаковыми молярными коэффициентами экстинкции при одинаковом вводимом количестве проявляются в виде пиков различной площади. В простейшем случае УФ-детектора это можно легко показать, если рассчитать время, за которое движущиеся объекты с различными скоростями проходят область УФ-детектирования.
Аналогичные явления встречаются при каждом разделении в КЭ. Компоненты пробы, которые первыми движутся мимо детектора, обладают высокой скоростью, поэтому ширина их пиков на самописце меньше. Если бы в КЭ отсутствовало уширение полос, то первые пики были бы самыми узкими, так как они перемещаются мимо детектора быстрее других.
Таблица 1.
Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от скорости миграции
Скорость пика [мм/с] Время пика в "окне" [с] Ширина пика на самописце [мм] 0.1 10 16 0.5 2.0 3.2 1.0 1.0 1.6 5.0 0.2 0.3 10 0.1 0.2 Скорость движения самописца: 60 см/мин. Таблица 14
Таблица 2.
Зависимость площади и ширины пика от времени миграции.
Время миграции Скорость перемещения [мм/с] Время в детекторе [с] Ширина пика на самописце [см] Площадь пика сигнала с h=10см [см2] 90 0.58 0.87 0.144 1.44 120 0.43 1.16 0.192 1.92 150 0.35 1.44 0.239 2.39
Если привести полученные площади пиков к времени миграции, то получим сигнал пробы, независящий от скорости перемещения. С помощью такого нормирования удается в некоторых случаях сгладить колебания времени миграции
Колебания ЭОП являются тем фактором, который через скорость миграции непосредственно влияет на площадь пика. Эксперименты ясно показывают, что после короткого времени установления равновесия могут быть получены воспроизводимые условия анализа. При замене буфера необходимо, однако, менять и капилляры или, по крайней мере, промывать их новым буфером от 10 до 15 минут. Так как ЭОП существенно более эффективно изменяет слой буфера на внутренней поверхности капилляра, чем приводимый в движение давлением поток, можно сильно сократить время установления равновесия, если промывать капилляр новым буфером и затем подвергать его действию электрического напряжения в течение 5-10 мин. Точное время уравновешивания капилляра нельзя привести, так как эта величина сильно зависит как от буфера, так и от конкретных стадий кондиционирования. Кроме того, на воспроизводимость результатов сильно влияет количество вводимой пробы.
При оптимизации анализа необходимо находить компромисс между воспроизводимостью и эффективностью. Если требуется количественно проанализировать пробу, то для получения надежных результатов следует работать с концентрациями, превышающими границу обнаружения, по крайней мере от 10 до 20 раз. Только при оптимальных условиях удается получить хорошую эффективность и высокую воспроизводимость площадей пиков в пределах от 1.5 до 3%.
Применение капиллярного электрофореза в фармации.
Контроль качества лекарственных препаратов. Определение качественного и количественного состава лекарственных препаратов (кофеин, анальгин, аскофен, ибупрофен, фенобарбитал, барбитал, кодеин, парацетамол, пенталгин и т.д.), анализ биогенных аминов (серотонин, норадреналин), анализ ароматических карбоксилатов, анализ пептидов.[7]
Выводы
Существуют разные методы разделения систем, применение которых основано на миграции, обусловленной электрическим полем. Наиболее часто применяемой системой является капиллярный электрофорез.
По сравнению с классическим электрофорезом КЭ имеет следующие преимущества:
очень высокая эффективность разделения;
простое детектирование в режиме реального времени и возможность количественного анализа;
простота хранения;
короткие времена анализов;
возможность автоматизации;
небольшой расход реактивов.
По сравнению с ВЭЖХ преимущества заключаются в следующем:
высокая эффективность разделения;
быстрое установление равновесия при изменении условий анализов.
Недостатки КЭ заключаются в следующем:
детектирование УФ-детекторами с низкой чувствительностью к изменению концентрации;
относительно плохая воспроизводимость и сложность управления ЭОП;
адсорбция анализируемых веществ на стенках капилляра, приводящая к потере эффективности.
Список используемой литературы
Аналитическая химия: проблемы и подходы. Т 2./ Р.Кельнер, Ж.-М. Мерме, М. Отто, Г.М. Видмер – М.: «Мир», 2004. – 726 с.
Воюцкий, С.С. Курс коллоидной химии. 2-е изд, доп. и перер. – М.: изд-во: «Химия», 1975. – 512 с.
Герасимова Я.И. Курс физической химии. Т1 – М.: «Химия», 1964. – 435 с.
Григоров О.Н. Электрокинетические явления. М.: Изд-во ЛГУ, 1973. – 168 с.
Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Часть 1. / Барбалат Ю.А., Власов Ю.Г., Демин В.А., Ермоленко Ю.Е. и др. – СПб.: АНО НПО «Мир и Семья», 2002. – 964 с.
Пасынский А.Г.Коллоидная химия. Изд. 2-е. М.: «Высшая школа», 1963. - 497 с.
Примеры применения метода капиллярного электрофореза. / Каменцев, Я.С., Заморянская, М.В., Комарова, Н.В. Журнал «Российский Химический журнал», №1, 1996
Электрические свойства капиллярных систем. (Сборник). Под ред. Ребиндера П.А. М.: Изд-во АН СССР, 1956. – 352 с.
Электроповерхностные явления в дисперсных системах. (Сборник). Под ред. Григорова О.Н., Фридрихберга Д.А. М.: «Наука», 1972. – 192 с.
Яков Г.В. Элементы метода капиллярного электрофореза. Журнал «Аналитическая химия», 2006, № 3.











22



детектор

Запись данных

Сосуд с буфером

Источник высокого напряжения

Сосуд с пробирками

Кварцевые капилляры

b

а